نیتروسلولز در مقابل غشای PVDF: کدام یک را باید استفاده کنید؟

پاسخ مستقیم: برای اکثر وسترن بلات‌ها، PVDF پیش‌فرض ایمن‌تر است - ظرفیت اتصال پروتئین بالاتری دارد (170-200 میکروگرم بر سانتی‌متر مربع در مقابل 80 تا 100 میکروگرم بر سانتی‌متر مربع)، دوام مکانیکی بهتری دارد و از جداسازی و بازیابی پشتیبانی می‌کند. اما نیتروسلولز پایین‌تر نیست - زمینه پایین‌تری دارد، مرحله فعال‌سازی متانول را ندارد و برای پروتئین‌های کوچک (<30-25 کیلو دالتون) بهتر است. انتخاب مناسب به اندازه و فراوانی پروتئین هدف، روش تشخیص شما و اینکه آیا نیاز به بررسی مجدد دارید یا خیر بستگی دارد. هیچ کدام از این دو غشاء به طور کلی «بهتر» نیستند.

نحوه کار هر دو غشا

هم نیتروسلولز و هم PVDF هستند غشاهای مسیر پرپیچ و خم - پروتئین ها از طریق یک شبکه سه بعدی از منافذ به هم پیوسته مهاجرت می کنند و به سطح داخلی متصل می شوند، نه فقط به صورت خارجی. این ساختار به هر دو غشا سطح اتصال موثر بسیار بالاتری نسبت به ابعاد مسطح آنها می دهد.

مکانیسم اتصال متفاوت است:

• نیتروسلولز پروتئین ها را از طریق فعل و انفعالات آبگریز و نیروهای الکترواستاتیک متصل می کند. این به طور طبیعی آبدوست است - بلافاصله توسط بافرهای آبی بدون هیچ گونه پیش تصفیه خیس می شود.
• PVDF (پلی وینیلیدین دی فلوراید) از طریق هر دو فعل و انفعالات آبگریز و دوقطبی-دوقطبی متصل می شود و به آن میل ترکیبی کل بیشتری برای اکثر پروتئین ها می دهد. آبگریز است - قبل از تماس با بافر انتقال آبی باید با متانول از قبل خیس شود، در غیر این صورت پروتئین متصل نمی شود.

این تفاوت در رفتار خیس شدن، شایع ترین منبع شکست انتقال PVDF در آزمایشگاه است. یک غشای PVDF که در اواسط آزمایش خشک می‌شود، باید قبل از ادامه دوباره خیس شود.

مقایسه سر به سر

فاکتور وزن مولکولی: آنچه که اکثر پروتکل ها اشتباه می کنند

رایج ترین جنبه اشتباه انتخاب غشا، رابطه بین وزن مولکولی و انتخاب غشا است.

توصیه مرسوم - "استفاده از PVDF برای تشخیص حساس، نیتروسلولز برای کارهای معمول" - یک نکته مهم را از دست می دهد. یک مطالعه سیستماتیک در سال 2021 منتشر شده در گزارش های علمی توانایی اتصال هر دو غشا را در بین پروتئین های با وزن مولکولی کم، متوسط و بالا مقایسه کرد. یافته ها عبارت بودند از:

• برای پروتئین های با وزن مولکولی کم (<25-30 کیلو دالتون): نیتروسلولز در مقایسه با PVDF حساسیت اتصال و تشخیص برابر یا برتر را نشان داد
• برای پروتئین های با وزن مولکولی متوسط و بالا (> 50 کیلو دالتون): PVDF اتصال و حساسیت بهتری را نشان داد

دلیل آن به ترکیب بافر انتقال مربوط می شود. پروتکل های انتقال نیتروسلولز معمولاً شامل متانول در بافر انتقال می شود. متانول اندازه منافذ ژل را در حین انتقال الکتریکی کاهش می دهد، که از برگشت پروتئین های کوچک به داخل ژل جلوگیری می کند - حفظ پروتئین های کوچک روی غشاء را بهبود می بخشد. با این حال، همین متانول تحرک پروتئین‌های بزرگ را از ژل کاهش می‌دهد و کارایی انتقال آنها را برای اهداف با MW بالا مختل می‌کند.

PVDF به متانول در بافر انتقال نیاز ندارد. بدون متانول، پروتئین‌های بزرگ با کارایی بیشتری منتقل می‌شوند - به همین دلیل است که PVDF برای پروتئین‌های بالای 100 کیلو دالتون به طور مداوم از نیتروسلولز بهتر عمل می‌کند.

راهنمای انتخاب عملی MW:

انتخاب اندازه منافذ

هر دو غشا در سه اندازه منافذ استاندارد موجود هستند. اندازه منافذ یک تصمیم جدا از مواد غشایی است - هر دو را به طور مستقل انتخاب کنید.

قانون: هنگامی که پروتئین هدف شما کوچک است (<15 کیلو دالتون) یا مقدار بارگیری شما کم است و تعیین کمیت بسیار مهم است، همیشه از 0.2 میکرومتر به جای 0.45 میکرومتر استفاده کنید - صرف نظر از مواد غشایی. اندازه کوچکتر منافذ باعث کاهش جریان پروتئین در حین انتقال می شود.

سازگاری روش تشخیص

انتخاب غشاء باید با استراتژی تشخیص شما هماهنگ باشد.

لومینسانس شیمیایی (HRP/ECL)

هر دو غشا کاملاً سازگار هستند. این رایج ترین روش تشخیص و کمترین تبعیض است - هر دو غشا کار می کند. اگر همه عوامل دیگر برابر هستند و از ECL استفاده می کنید، بر اساس MW پروتئین و نیازهای بازپروری انتخاب کنید.

فلورسانس (نزدیک مادون قرمز، مولتی پلکس دو رنگ)

از PVDF با فلورسانس کم استفاده کنید. نیتروسلولز استاندارد دارای اتوفلورسانس بالایی است که به کانال های تشخیص فلورسانس نفوذ می کند - پس زمینه بالا تولید می کند که سیگنال های ضعیف را پنهان می کند و مالتی پلکس دو رنگ را غیرقابل اعتماد می کند. PVDF استاندارد همچنین دارای اتوفلورسانس متوسط ​​است. برای وسترن بلات مبتنی بر فلورسانس (به عنوان مثال، سیستم های LI-COR Odyssey)، مشخص کنید PVDF با فلورسانس کم به صراحت - این یک دسته محصول متمایز است، نه فقط PVDF استاندارد.

رنگ سنجی (AP/BCIP-NBT، HRP/DAB)

هر دو غشا سازگار هستند. نیتروسلولز به دلیل ویژگی های مسدود کننده بهتر، تمایل به ایجاد زمینه کمتر با بسترهای رنگ سنجی دارد.

رادیواکتیو (32P، 125I)

هر دو سازگار. نیتروسلولز استاندارد تاریخی برای تشخیص رادیواکتیو است و برای این کاربرد کمی ارجح است.

برهنه کردن و بازپروری

اگر آزمایش شما نیاز به کاوش یک غشا با بیش از یک آنتی بادی اولیه دارد - چه به صورت متوالی برای اهداف مختلف و چه پس از جداسازی برای بررسی مجدد با یک کنترل بارگذاری - دوام غشاء حیاتی می‌شود.

نیتروسلولز استاندارد شکننده است پروتکل‌های حذف شامل بافرهای SDS با دمای بالا یا عوامل کاهنده (β-مرکاپتواتانول) به طور مکانیکی به غشاء آسیب می‌رسانند و باعث از دست رفتن پروتئین می‌شوند. سیگنال پس از پروب دوم معمولاً 30 تا 60 درصد از پروب اول است. پس از سه چرخه، غشاء اغلب غیر قابل استفاده است.

نیتروسلولز پشتیبانی شده (پشت پشتی پلی استر یا نایلون) به طور قابل توجهی بادوام تر است و می تواند بهتر از NC بدون پشتیبانی در برابر کنده شدن و بازیابی مقاومت کند - اما همچنان نسبت به PVDF پایین تر است.

PVDF از نظر شیمیایی مقاوم و از نظر مکانیکی مقاوم است. در برابر چرخه های متعدد سلب با حداقل از دست دادن سیگنال مقاومت می کند. غشاهای PVDF با موفقیت 5 تا 7 بار در جریان‌های کاری تحقیقاتی مورد بررسی قرار گرفته‌اند.

سوال متانول: پیامدهای بافر انتقال

پیش خیس کردن PVDF در متانول قبل از انتقال اختیاری نیست - اجباری است. PVDF آبگریز است: اگر غشاء قبل از فعال شدن متانول با بافر انتقال آبی تماس پیدا کند، کشش سطحی مانع از نفوذ بافر می شود و پروتئین متصل نمی شود. نتیجه یک غشای خالی بدون باند است، که یکی از دلایل رایج شکست وسترن بلات PVDF در آزمایشگاه‌های بی‌تجربه است.

پروتکل فعال سازی PVDF:

1. غشا را به مدت 15 تا 30 ثانیه در متانول 100% خیس کنید تا شفاف شود.
2. شستشوی مختصر در بافر انتقال (30 ثانیه)
3. به مدت 5 دقیقه در بافر انتقال تعادل برقرار کنید
4. بلافاصله انتقال را ادامه دهید - اجازه ندهید PVDF خشک شود

برای خود بافر انتقال:

• با نیتروسلولز: بافر استاندارد Towbin (25 میلی‌مولار تریس، 192 میلی‌مولار گلیسین، 20 درصد متانول) پیش‌فرض است. متانول موجود در بافر حفظ پروتئین کوچک را بهبود می بخشد اما انتقال پروتئین بزرگ را مختل می کند.
• با PVDF: متانول موجود در بافر انتقال برای فعال شدن غشاء مورد نیاز نیست (دسته های از پیش خیس آن). برای پروتئین های بزرگ (> 100 کیلو دالتون)، استفاده از متانول کم (5-10٪) یا بافر انتقال بدون متانول با 0.1٪ SDS به طور قابل توجهی کارایی انتقال را بهبود می بخشد.

وقتی نیتروسلولز انتخاب بهتری است

با وجود برتری کلی PVDF در ظرفیت اتصال و دوام، نیتروسلولز در سناریوهای خاص برنده است:

پروتئین های کوچک (<25-30 کیلو دالتون): بافر انتقال متانول NC پروتئین های کوچک را بهتر از PVDF بدون متانول حفظ می کند. برای اهدافی مانند هیستون ها (11-17 کیلو دالتون)، β-اکتین (42 کیلو دالتون، نزدیک به مرز)، و سیتوکین ها (8-25 کیلو دالتون)، NC عملکرد قابل مقایسه یا بهتری دارد.

برنامه های معمول و یکبار مصرف با پروتئین های فراوان: اگر هدف به شدت بیان شود، نویز پس‌زمینه بیشتر از حساسیت مهم است - و NC پس‌زمینه کمتری را ارائه می‌دهد. برای یک لکه معمولی کنترل کیفیت روی یک پروتئین با بیان بالا و بدون بازرسی، NC ارزان تر و ساده تر است.

عدم تحمل متانول: برخی از آزمایشگاه ها از متانول برای ایمنی، دفع زباله یا به دلیل ناسازگاری سیستم انتقال آنها با بافرهای متانول بالا اجتناب می کنند. NC این نگرانی را به کلی از بین می برد.

تشخیص اسید نوکلئیک (لکه های جنوبی / شمالی): NC با هیبریداسیون DNA و RNA سازگار است. PVDF برای بلات اسید نوکلئیک مناسب نیست.

لکه‌کردن نقطه و اسلات بلاتینگ: NC استاندارد تاریخی برای این کاربردها است و همچنان به طور گسترده مورد استفاده قرار می گیرد.

وقتی PVDF غیر قابل مذاکره است

تجزیه و تحلیل پایین دست طیف سنجی جرمی: اگر قصد دارید نوارهای پروتئینی را جدا کنید و آنها را برای شناسایی یا توالی یابی LC-MS/MS ارسال کنید، PVDF تنها غشای سازگار است. نیتروسلولز با تجزیه ادمن (توالی یابی پروتئین) و با اکثر پروتکل های آماده سازی نمونه MS ناسازگار است.

وسترن بلات مبتنی بر فلورسانس: PVDF با فلورسانس پایین تنها فرمت غشایی است که با مالتی پلکس فلورسانس NIR سازگار است. اتوفلورسانس NC آن را غیرقابل استفاده می کند.

پروتئین های با وزن مولکولی بالا (> 100 کیلو دالتون): باندهای ثابت و با کیفیت بالا برای اهداف بزرگ (مانند mTOR در 289 کیلو دالتون، تیتین در 3000 کیلو دالتون) به PVDF با بافر انتقال کم متانول یا بدون متانول نیاز دارند.

چرخه های بازپروری چندگانه: هر طرح آزمایشی که به بیش از دو دور جداسازی و شناسایی مجدد نیاز دارد باید از PVDF استفاده کند.

ذخیره سازی طولانی مدت غشایی: غشاهای PVDF را می توان به صورت خشک در دمای اتاق ذخیره کرد و ماه ها یا سال ها بعد بدون از دست دادن سیگنال دوباره هیدراته شد. NC با گذشت زمان و ذخیره سازی تخریب می شود.

عیب یابی: مشکلات رایج بر اساس نوع غشاء

خلاصه: چارچوب تصمیم

از نیتروسلولز استفاده کنید اگر:

• پروتئین هدف MW < 25-30 کیلو دالتون
• پروتئین به شدت بیان می شود (هدف فراوان، پس زمینه کم می خواهید)
• فقط یک پروب - بدون نیاز به کاوش مجدد
• تشخیص رنگ سنجی یا لومینسانس شیمیایی است
• کاربرد بلات اسید نوکلئیک (جنوبی / شمالی) است.
• بودجه محدود است. بلات معمولی با توان عملیاتی بالا

از PVDF استفاده کنید اگر:

• پروتئین هدف MW > 50 کیلو دالتون، به ویژه > 100 کیلو دالتون
• پروتئین کم فراوانی است (پروتئین های سیگنال دهنده، فاکتورهای رونویسی)
• پروب های متعدد یا چرخه های سلب مورد نیاز است
• تشخیص مبتنی بر فلورسانس است (از PVDF با فلورسانس کم استفاده کنید)
• کاربرد پایین دست طیف سنجی جرمی یا توالی یابی پروتئین است
• غشاء و فرآیندهای غشایی باید بعداً ذخیره و مجدداً بررسی شوند

وقتی واقعاً مهم نیست: هر دو غشا نتایج قابل مقایسه ای را برای پروتئین های فراوان با MW متوسط (30-80 کیلو دالتون) تولید می کنند که توسط نورتابی شیمیایی با یک آنتی بادی منفرد شناسایی شده اند. اگر هدف شما بتا اکتین، GAPDH یا دیگر پروتئین خانه دار با بیان بالا در مقادیر بارگیری طبیعی باشد، هر دو غشاء کار می کنند. از هر چیزی که قبلاً در آزمایشگاه است استفاده کنید.